Responsável: Marcus Vinícius de Assis Silva - Gerente de P&D - myOZONE
Colaborador: Nicolas Oliveira de Araújo - Doutorando Fitotecnia - UFV
Supervisor: Vivaldo Mason Filho - Diretor - myOZONE
Viçosa (MG). 23 de agosto de 2022
1. Introdução
A cebola (Allium cepa) é uma hortaliça de importância culinária e medicinal, sendo cultivada extensivamente em mais de 170 países (Bahram‐Parvar et al., 2018). A cebola constitui-se de um bulbo e assim como as demais culturas que apresentam tubérculos, as cebolas apresentam o caule subterrâneo. As cebolas são muito susceptíveis a várias doenças que podem ser transmitidas pelo solo durante o seu crescimento. Os sintomas dessas doenças podem não ser visíveis quando ainda estão no campo, no entanto, as contaminações por bactérias e fungos patogênicos continuam após a colheita. Dentre as principais doenças que ocorrem na pós-colheita de cebola destaca-se a podridão mole causada pela bactéria Erwinia carotovora e o mofo preto causado por Aspergillus niger e (Khalifa et al., 2016).
A podridão mole bacteriana é causada pela bactéria Erwinia carotovora pv carotovora, sendo um problema comum em muitas hortaliças principalmente durante o armazenamento. Geralmente se desenvolve em cebolas após chuvas fortes ou após irrigação com água contaminada. Esta doença é principalmente um problema em bulbos de cebola maduros em condições ambientes quentes e úmidas durante o armazenamento. A bactéria faz com que as folhas centrais das cebolas fiquem pálidas e desmoronem. As escamas infectadas dos bulbos são inicialmente encharcadas de água e depois aparecem amarelas ou marrom-claras (Figura 1). Em estágios avançados de infecção, os catáfilos tornam-se moles e aquosas e se desfazem facilmente. À medida que o interior do bulbo se decompõe, um líquido fétido enche a área central do bulbo. (Muimba-Kankolongo, 2018).
Figura 1 - Presença da bactéria Erwinia carotovora em cebola “podridão mole”. (a) Fonte: Muimba-Kankolongo, A. (2018); (b) Fonte: Silva, (2022).
O mofo preto pode se desenvolver em qualquer lugar e pode ser visto na superfície do bulbo e no interior das bases das folhas (Figura 2). Os esporos de A. niger podem ser transmitidos pelo contanto com o solo ou ar (El-Nagerabi & Ahmed, 2003). Além da deterioração causada aos bulbos, os fungos do gênero Aspergillus produzem micotoxinas, que são cancerígenas tanto para animais quanto para humanos.
Figura 2 - Presença de A. niger em bulbos de cebola. Fonte: Borkar et al. (2020).
O uso do ozônio, tanto na forma aquosa quanto gasosa, tem sido defendido por seu amplo espectro de atividade antimicrobiana que tem um efeito notável no controle de bactérias, fungos, vírus, protozoários e esporos (bacterianos e fúngicos). Devido a essa característica, tem havido considerável interesse de pesquisa no campo do processamento de ozônio com pesquisadores e fabricantes de geradores que pretendem integrar o ozônio na indústria de alimentos como agente sanitizante.
O ozônio é um forte agente oxidante que foi aprovado com o status GRAS (Generally Recognized As Safe) pelo US-FDA (Graham, 1997) para uso no processamento de alimentos como um substituto potencial para agentes à base de cloro. As fortes propriedades desinfetantes do ozônio aquoso estão associadas aos radicais livres que desintegram as paredes das células microbianas devido ao estresse oxidativo induzido (Aslam, Alam, & Saeed, 2020). O gás ozônio é gerado no próprio local através de um gerador de ozônio e não pode ser armazenado, uma vez que se desintegra em oxigênio atmosférico não deixando resíduos nos alimentos tratados.
A viabilidade da utilização do ozônio em um processo na indústria de alimentos é muitas vezes estimada em termos da extensão dos efeitos nocivos percebidos na qualidade do produto e reduções na carga microbiana durante a exposição ao ozônio. Portanto, é importante otimizar os parâmetros do processo para alcançar uma sanitização eficaz e que garanta a qualidade do produto final (Aslam et al., 2020; Aslam et al., 2021). Para isso são necessários a realização de testes de aplicação e desenvolvimento de protocolos para uma aplicação segura e eficiente do ozônio em produtos agrícolas. Dessa forma, os objetivos desse estudo preliminar foram: (i) determinar o efeito da aplicação do gás ozônio na descontaminação fúngica e (ii) determinar o efeito do ozônio na qualidade dos bulbos de cebolas.
2. Material e métodos
2.1.Ozonização dos bulbos de cebola
O experimento foi realizado no Laboratório de Pós-colheita do Departamento de Engenharia Agrícola da Universidade Federal de Viçosa. As cebolas para a realização dos testes preliminares foram adquiridas em supermercado local. Para o tratamento dos bulbos de cebola foi utilizado um gerador 5 g modelo M 5 (myOZONE, Jaguariúna, São Paulo, Brasil) na concentração de 5 mg L-1 e vazão volumétrica de 2 L min-1. O gerador de ozônio foi alimentado por um concentrador de oxigênio modelo EverFlo (Philips Respironics, Murrysville, Pensilvânia, EUA). A quantificação da vazão volumétrica de oxigênio foi feita por um medidor de vazão modelo MF5700 (Siargo Ltd, Chengdu, Sichuan, China). A concentração de ozônio foi mensurada pelo método iodométrico que é considerado pela IOA o método oficial (Rakness et a., 1996).
Inicialmente uma massa de 1 kg de cebolas foram expostas a concentração de 5 mg L-1 por um período de 10, 30 e 60 min. O tratamento controle foi feito com aplicação de oxigênio (O2), nas condições utilizadas na aplicação do gás ozônio. Após exposição ao ozônio, as cebolas foram armazenadas por 33 dias. Parte dessas cebolas foram armazenadas em câmara na temperatura de 25 ± 2°C. As demais cebolas foram armazenadas em câmara refrigerada na temperatura de 6,5 ± 2°C, sendo que nas cebolas armazenadas em câmara fria foi aplicada uma concentração de ozônio de 5 mg L-1 por 30 min, durante os 33 dias de armazenamento.
Para o tratamento das cebolas armazenadas em câmara fria foi utilizada uma câmara de acrílico nas dimensões (0,69 x 0,5 x 0,5 m) dotada de um sistema de ventilação (Figura 1b). O sistema de ventilação permitia o ajuste da velocidade do ar para 1,9 m s-1 (Figura 1d) a fim de favorecer a distribuição e o contato do gás ozônio com os bulbos de cebola. Para o tratamento no interior da câmara de acrílico foi utilizado uma massa de 3 kg de cebola.
Figura - Esquema experimental para a ozonização dos bulbos de cebola (a). Câmara para exposição dos bulbos de cebola ao gás ozônio por 30 minutos diários durante o armazenamento dos bulbos refrigerados (b) e (c). Anemômetro para medir a velocidade do ar no sistema de ventilação da câmara para o tratamento dos bulbos (d).
1.1.Descontaminação fúngica
Para determinar o potencial do ozônio na inativação de fungos, foi feito o plaqueamento direto de pedaços das escamas mais externas dos bulbos de cebola, uma vez que os fungos, principalmente o A. níger ocorrem na superfície das cebolas. O plaqueamento direto dos pedaços de cebola foi feito em meio de cultura do tipo BDA. Para o preparo pesou-se 50 g do meio agar batata dextrose (HIMEDIA – Lote 0000424891) em balança analítica de precisão ao qual foi diluído para 1 Litro (L) de água destilada até o meio ficar homogêneo. Em seguida, o meio foi aquecido em micro-ondas em curtos intervalos de tempo (2 minutos) até que o meio estivesse completamente fundido e homogeneizado. Após esse processo, o meio de cultura foi autoclavado por 20 minutos na temperatura de 121 ° C. Cerca de 15 a 20 mL foram vertidos nas placas de petri (Figura 2a) e após a solidificação do meio foi feito o plaqueamento dos pedaços de cebola (Figura 2b). Após o plaqueamento, foi feita a incubação das placas por um período de 48 horas em B.OD.
Figura 2 - Preparo das placas com o meio de cultura em câmara de fluxo laminar (a) e plaqueamento das escamas externas da cebola (b) e placas de petri prontas para a incubação em BOD (c).
2.3. Análises de qualidade
2.3.1. Perda de massa
As amostras foram pesadas em balança semianalítica digital com precisão de 0,01 g modelo BK 8000 (Gehaka, São Paulo, Brasil). O percentual de perda de massa fresca consiste na diferença entre a massa inicial de cada amostra no dia 0 e aos 3, 5, 7, 11, 18, 25 e 33 dias de armazenamento, multiplicada por 100 e dividida pela massa inicial (Equação 1).
Em que: representa o percentual de perda de massa do dia avaliativo, a massa inicial da amostra no dia 0 e a massa da amostra do dia avaliado. Os resultados foram expressos em porcentagem (%).
2.3.2. Cor
A avaliação da cor dos bulbos de cebola foi feita através da leitura direta de reflectância das coordenadas L* (intensidade de branco a preto), a* (intensidade de vermelho a verde), e b* (intensidade de amarelo a azul) utilizando um colorímetro modelo CR410 (Konica Minolta, Osaka, Japão) (Figura 3). A partir dos valores de L*, a* e b* foram determinados a tonalidade de cor ou hue angle (h*, Equação 2) e a saturação de cor ou chroma (C*, Equação 3). As leituras de cor foram feitas em locais pré-determinados nos bulbos imediatamente após exposição ao ozônio e durante todo o período de armazenamento.
(2)
(3)
Figura 3 - Colorímetro para a mensuração das coordenadas L*, a* e b* dos bulbos de cebola.
2.3.3. Índice de germinação
A determinação do índice de germinação foi feita a partir do corte das cebolas e medida direta com o auxilio de um paquímetro do comprimento do bulbo e do comprimento do broto (Figura 4). A partir dessas dimensões foi determinada a relação entre o comprimento do broto e o comprimento do bulbo.
Figura 4 - Indicação do local onde foi determinado o comprimento do broto e o comprimento do bulbo para o cálculo do índice de germinação.
2.3.4. Pungência
O conteúdo de ácido pirúvico tem sido utilizado como um indicador para a pungência de cebola e foi analisado pelo teste do corante 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) como sugerido por Randle e Bussard (1993). O preparo das amostras de cebola consistiu em adicionar água destilada na proporção de 1:1 e triturar o material com o processador de alimentos Mixer Philips Walita 300 W (Figura 5a). Após o material ter sido processado, foi feita uma pré-filtragem (Figura 5b) e posteriormente foi feito a filtragem final utilizando um microfiltro fibra de vidro GF-6 (Macherey-Nagel, Alemanha) (Figura 5c). A parti desse filtrado, 100 µL de alíquota foi adicionado a cada 1500 µL de água destilada e 900 µL DNPH e mantido por 30 min. Finalmente, KOH 5 mol L-1 foi adicionado à mistura e as leituras de absorbância foram feitas a 485 nm. Uma curva padrão de ácido pirúvico (Figura 6a) foi utilizada para estimar as concentrações finais de ácido pirúvico por espectrofotometria (Figura 6b).
Figura 5 - Procedimento experimental para o prepara das amostras para a mensuração do conteúdo de ácido pirúvico em cebola.
Figura 6 - Curva-padrão de ácido pirúvico (a) e procedimento experimental para a leitura de ácido pirúvico por espectrofotometria (b).
3. Resultados e discussão
3.1. Descontaminação fúngica
A Figura 7 mostra o plaqueamento direto dos pedaços das escamas externas dos bulbos de cebola após 48 horas de incubação. De todos os tratamentos estudados, os bulbos de cebola expostos ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante os 33 dias de armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) foram as únicas amostras onde a concentração de ozônio foi suficiente para a inativação dos esporos dos fungos presentes na cebola.
Figura 7 - Plaqueamento direto dos pedaços das escamas externas dos bulbos de cebola expostos ao ozônio e ao oxigênio (controle) em diferentes períodos de exposição.
3.2.Análises de qualidade
3.2.1. Perda de massa
A Figura 8 apresenta a perda de massa durante o armazenamento de bulbos de cebola expostos ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante o armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) e perda de massa de bulbos de cebola expostos ao ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60, 30 e 10 min armazenados na temperatura de 25 ± 2°C. A perda de massa no 33° dia entre os diferentes tratamentos variou de 1,7 a 4,6%, sendo que as amostras expostas ao ozônio por 10 min na concentração de 5 mg L-1 foi o tratamento que apresentou maior porcentagem de perda de massa. Muito da perda de massa observada neste teste preliminar pode estar associada a germinação das cebolas, pois maior a germinação, maior será o metabolismo e consequentemente maior é o consumo de matéria seca.
Figura 8 - Perda de massa durante o armazenamento de bulbos de cebola expostos ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante o armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) e perda de massa de bulbos de cebola expostos ao ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60, 30 e 10 min armazenados na temperatura de 25 ± 2°C.
3.2.2. Cor
A Figura 8 apresenta gráficos para croma (Cr*) (a), luminosidade (L*) (b) e tonalidade de cor (h*) (c) nos 0, 10° e 30° dia de armazenamento dos bulbos de cebola expostos ao gás ozônio e ao oxigênio (controle). As variáveis de cor analisadas não sofreram alterações substanciais que viessem a comprometer o produto comercialmente. De acordo com a Figura 8a apenas o Cr* apresentou variação, mas para saber se essa variação é significativa são necessários a realização de testes com mais repetições para se obter um resultado com maior segurança estatística. As Figura 10, 11 e 12 do material suplementar trazem fotos das cebolas durante o armazenamento.
Figura 9 - Gráficos para croma (Cr*) (a), luminosidade (L*) (b) e tonalidade de cor (h*) (c) durante o período de armazenamento para os bulbos de cebola expostos ao gás ozônio e ao oxigênio (controle).
Figura 10 - Imagens das cebolas no primeiro dia de armazenamento.
Figura 11 - Imagens das cebolas no décimo dia de armazenamento.
Figura 12 - Imagens das cebolas no trigésimo dia de armazenamento.
3.2.3. Índice de germinação
A Figura 13 apresenta o índice de germinação dos bulbos de cebola expostos ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante o armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) e para os bulbos de cebola expostos ao ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60, 30 e 10 min armazenados na temperatura de 25 ± 2°C. A Figura 14 mostra os bulbos cortados e a presença do broto em alguns casos. O tratamento com ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60 min foi o que apresentou o maio índice de germinação, sendo muito provável que essa condição induza a quebra de dormência das cebolas. Seguido desse tratamento, o que apresentou maior índice de germinação foram as cebolas armazenadas em câmara fria que foram expostas ao ozônio durante os 33 dias de armazenamento por 30 minutos. Entretanto não significa dizer que o ozônio foi o único responsável por este resultado, uma vez que a temperatura é um fator muito importante na quebra de dormência dos bulbos de cebola. Um estudo desenvolvido por Miedema, (1994) demonstrou que o armazenamento na temperatura de 5 a 20°C induz a quebra de dormência em cebolas.
Figura 13 - Índice de germinação dos bulbos de cebola expostos ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante o armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) e para os bulbos de cebola expostos ao ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60, 30 e 10 min armazenados na temperatura de 25 ± 2°C.
Figura 14 - Imagens dos bulbos de cebola cortados e presença do broto em alguns tratamentos
A Figura 15 apresenta a concentração de ácido pirúvico nos bulbos de cebola expostos ao gás ozônio ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante o armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) e para os bulbos de cebola expostos ao ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60, 30 e 10 min armazenados na temperatura de 25 ± 2°C. Embora ainda não seja possível afirmar com segurança estatística, percebe-se que a concentração de ácido pirúvico nas cebolas foi superior nos tratamentos com maior dose de gás ozônio aplicado.
Figura 15 - Concentração de ácido pirúvico em bulbos de cebola expostos ao gás ozônio na concentração de 5 mg L-1 d-1 durante o armazenamento refrigerado (6 ± 2°C) e para os bulbos de cebola expostos ao ozônio na concentração de 5 mg L-1 por 60, 30 e 10 min armazenados na temperatura de 25 ± 2°C.
4. Conclusão
4.1 Desinfecção fúngica
A aplicação do ozônio durante 30 minutos durante os 33 dias de armazenamento na concentração de 5 mg L-1 foi suficiente para a desinfecção fúngica dos bulbos de cebola. Portanto a maior causa de baixa durabilidade da cebola armazenada pode ser efetivamente eliminada com o uso do gás ozônio.
4.2 Cor
A cor das cebolas não foi alterada em função dos tratamentos com gás ozônio.
4.3 Índice de germinação
O índice de germinação das cebolas variou em função dos tratamentos com gás ozônio. Nos bulbos de cebola expostos ao gás ozônio foi perceptível uma maior quebra de dormência nas condições testadas. Entretanto sugere-se testar a aplicação de ozônio em cebolas armazenadas a temperatura um pouco acima de 20ºC para ver se a quebra da dormência foi devido à temperatura ou ao ozônio pois, como dito acima, um estudo desenvolvido por Miedema, (1994) demonstrou que o armazenamento na temperatura de 5 a 20°C induz a quebra de dormência em cebolas.
4.4 Perda de massa
A perda de massa também variou em função do tratamento com gás ozônio e esta variação na perda de massa pode estar relacionada a quebra de dormência dos bulbos. Mas vale ressaltar que a perda de massa foi de aproximadamente 1% quando comparada a aplicação do ozônio durante 30 minutos durante os 33 dias de armazenamento com o controle.
4.5 Pungência
A concentração de ácido pirúvico variou em função do tratamento, apresentando valores superiores nos bulbos expostos a uma maior dose de ozônio. O que pode ser uma alteração desejável comercialmente para as cebolas. Entretanto, para comprovar o efeito do ozônio no índice de germinação, na perda de massa e no conteúdo de ácido pirúvico são necessários a realização de mais testes para confirmar essa hipótese com maior segurança estatística.
5. Referências
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Bahram‐Parvar, M., & Lim, L. T. (2018). Fresh‐cut onion: A review on processing, health benefits, and shelf‐life. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 17(2), 290-308.
Borkar, S. G., Phule, M., Vidyapeeth, K., & Ts, A. (2020). Aspergillosis of onion, a concern for human health. British Journal of Medical and Health Sciences (BJMHS), 2, 638-647.
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Muimba-Kankolongo, A. (2018). Food Crop Production by Smallholder Farmers in Southern Africa: Challenges and Opportunities for Improvement.
Rakness, K., Gordon, G., Langlais, B., Masschelein, W., Matsumoto, N., Richard, Y., ... & Somiya, I. (1996). Guideline for measurement of ozone concentration in the process gas from an ozone generator. Ozone: Science & Engineering, 18, 209-229.
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